2025年2月12日 ，大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院林佳奇團(tuán)隊(duì)，在《Molecular Therapy - Nucleic Acids》上發(fā)表題為" Enhancing mRNA translation efficiency by introducing sequence optimized AU-rich elements in 3′UTR via HuR anchorage "的研究論文。
本次實(shí)驗(yàn)中，幾種脂質(zhì)納米顆粒(LNP)的制備全程采用艾特森微流控制備儀MPE-L2完成。該設(shè)備具備流量可控、混合效率高等特點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)LNP的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；苽?，有效保證了不同組別LNP產(chǎn)物的均一性與穩(wěn)定性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性提供了設(shè)備支撐。
研究背景
mRNA技術(shù)在疫苗研發(fā)、免疫治療等多個生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，其憑借精準(zhǔn)表達(dá)目標(biāo)蛋白、研發(fā)周期短、安全性較高等優(yōu)勢，成為近年來的研究熱點(diǎn)。然而，mRNA自身存在胞內(nèi)穩(wěn)定性低、目標(biāo)蛋白表達(dá)持續(xù)時間短暫等關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，嚴(yán)重制約了該技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化落地與臨床應(yīng)用推進(jìn)。針對這一問題，本次研究重點(diǎn)聚焦3'非翻譯區(qū)(3'UTR)序列優(yōu)化，提出通過插入富腺苷酸/尿苷酸元件(AU-rich elements, ARE)結(jié)合RNA結(jié)合蛋白HuR，提升mRNA穩(wěn)定性與翻譯效率的新策略。
1. 實(shí)驗(yàn)過程
? LNP制備過程：
圖例1：LNP制備過程
? 制備LNPs工藝條件：
基于上述研究策略與艾特森微流控設(shè)備，本次實(shí)驗(yàn)成功制備出三種LNPs：
a)Non-ARE：不含AU rich元件；
b)ARE-F：將AU rich元件插在3’UTR前端；
c)ARE-T60：重復(fù)序列長度為60bp。
2. ARE插入3'UTR的位置篩選
研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)含不同3'UTR ARE插入位點(diǎn)(起始ARE-F、中間ARE-M、末端ARE-R)的熒光素酶mRNA，以無ARE的Non-ARE為對照。體外轉(zhuǎn)染5種細(xì)胞系后，ARE-F組的熒光素酶表達(dá)和RNA豐度均顯著高于其他組，且趨勢一致。時間動態(tài)檢測顯示，ARE-F組48小時RNA豐度為Non-ARE組的4.8倍，蛋白表達(dá)峰值延遲至24小時。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，ARE-F組在小鼠體內(nèi)6、24、48小時的生物發(fā)光信號均強(qiáng)于Non-ARE組，延長了高蛋白表達(dá)窗口。
圖例2：ARE插入3'UTR的位置篩選
3.HuR蛋白與ARE結(jié)合的必要性驗(yàn)證
為明確分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)開展HuR沉默實(shí)驗(yàn)和RNA下拉實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染siHuR后，細(xì)胞內(nèi)HuR蛋白減少60%，ARE-F組熒光素酶表達(dá)和RNA豐度顯著下降，Non-ARE組無變化。RN下拉實(shí)驗(yàn)中，僅生物素標(biāo)記的ARE-F探針組檢測到35kDa的HuR蛋白條帶，對照組未檢測到，證實(shí)HuR與ARE-F存在特異性結(jié)合，且該結(jié)合是ARE發(fā)揮作用的關(guān)鍵。
圖例3：HuR蛋白與ARE結(jié)合的必要性驗(yàn)證
4.ARE序列的理性設(shè)計(jì)與優(yōu)化
從天然基因庫篩選13種ARE序列，僅含重復(fù) “AUUUA” 的ARE-5、ARE-9與ARE-F能顯著提升蛋白表達(dá)。對ARE-F(50nt)截短后，鑒定出9nt的最短功能序列AUUUAUUUA(ARE-V8)，其增強(qiáng)效果與全長一致。進(jìn)一步優(yōu)化 “AUUUA” 重復(fù)長度發(fā)現(xiàn)，60nt的ARE-T60增強(qiáng)效果優(yōu)，蛋白表達(dá)和RNA豐度均高于ARE-F。該效果在不同細(xì)胞系、體內(nèi)模型中均驗(yàn)證成立，且不受核苷酸修飾和UTR類型限制。
圖例4：ARE序列的理性設(shè)計(jì)與優(yōu)化
5.優(yōu)化后ARE的廣譜應(yīng)用價值驗(yàn)證
構(gòu)建EGFP、mCherry、OVA 的ARE-F/ARE-T60優(yōu)化載體，通過激光共聚焦、流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)，優(yōu)化組蛋白表達(dá)量顯著高于原始序列組。小鼠免疫實(shí)驗(yàn)中，OVA-ARE-T60誘導(dǎo)的IFN-γ分泌細(xì)胞數(shù)量約為原始OVA組的2倍，OVA特異性IgG抗體水平也顯著更高。共轉(zhuǎn)染Hu質(zhì)粒與ARE-F mRNA可進(jìn)一步提升熒光素酶表達(dá)，表明增強(qiáng)HuR表達(dá)能放大ARE的調(diào)控效果，證實(shí)優(yōu)化后的ARE可作為通用型翻譯增強(qiáng)工具。
圖例5：優(yōu)化后ARE的廣譜應(yīng)用價值驗(yàn)證
知識分享：研究亮點(diǎn)
1 提出在mRNA的3'UTR起始位置插入富腺苷酸/尿苷酸元件(ARE)的新策略，通過錨定胞質(zhì)RN結(jié)合蛋白HuR，同步提升mRNA的胞內(nèi)穩(wěn)定性與翻譯效率。
2 明確“AUUUA”是ARE的核心功能元件，鑒定出9nt的最短有效序列(AUUUAUUUA)，并優(yōu)化得到60nt的最優(yōu)序列(ARE-T60，其增強(qiáng)效果不受核苷酸修飾和UTR類型限制。
3 證實(shí)優(yōu)化后的ARE序列具有廣譜適用性，可顯著提升熒光蛋白、抗原(如 OVA)等多種蛋白的表達(dá)，且能增強(qiáng)mRNA疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答。
參考文獻(xiàn)：
Molecular Therapy - Nucleic Acids ( IF 6.1 ) Pub Date : 2025-02-12 , DOI: 10.1016/j.omtn.2025.102485.
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